Для гистологического исследования берут кусочки органов и тканей величиной не более 1 смі. Материал желательно получать как можно раньше после смерти людей (метод исследования материала трупа человека — аутопсия).
С диагностической целью материал для гистологического исследования может забираться у людей прижизненно с помощью специальных инструментов или во время операций. Этот способ получения материала носит название биопсии.
2. Фиксация
Взятый для гистологического исследования материал сразу же должен подвергаться фиксации. Фиксация — метод обработки ткани с целью закрепления ее прижизненной структуры. Это достигается путем воздействия на ткань специальных растворов (фиксаторов).
Наиболее существенным изменением, происходящим в тканях под воздействием фиксатора является процесс свертывания (коагуляции) белков. Количество фиксатора следует брать в 20-100 раз больше объема кусочка фиксируемого материала.
Существуют фиксаторы простые и сложные. К простым относятся 10-20% раствор формалина, 96 є спирт, 100 (абсолютный) спирт, 1-2% раствор осмиевой кислоты и др. Сложные фиксаторы: спирт — формол (спирт 70є — 100 мл. и формалин 2-5 мл.) жидкость Ценкера (сулема — 5 г, сернокислый натрий — 1 г., двухромовокиолый калий — 2,5 г, дистиллированная вода — 100 мл., ледяная уксусная кислота 5 мл.) и др. Продолжительность фиксации — от нескольких часов до 1 суток и более в зависимости от свойств фиксатора и характера исследуемого материала.
3. Помывка в воде
После фиксации материал промывают (чаще всего в течение нескольких часов в проточной воде) с тем, чтобы избавить его от избытка фиксатора и различных осадков фиксирующих жидкостей.
Изучить с помощью микроскопа такие фиксированные кусочки органов невозможно, т.к. они не прозрачны. Чтобы кусочек органа можно было микроскопировать, его надо разрезать на очень тонкие пластинки — срезы, толщина которых измеряется в микрометрах. Такие срезы получают с помощью специальных приборов — микротомов. Но для того, чтобы резать на микротоме кусочек ткани, ее надо предварительно уплотнить. Это достигается путем пропитывания застывающими жидкостями — расплавленным парафином. Парафин в воде не растворяется, и поэтому промытый после фиксации кусочек ткани необходимо предварительно обезводить, и только затем пропитывать.
4. Обезвоживание
Обезвоживание ткани производятся постепенно (чтобы не произошло сморщивания) путем проведения ее через спирты возрастающей крепости: 50є, 60є, 70є, 80є, 90є, 96є, 100є. В каждом спирте кусочки находятся от нескольких часов до 1 суток в зависимости от величины кусочка.
Филипас 1. Термодинамическое исследование скважин
... пласта для определения его параметров. Эти исследования также можно применять и для изучения газовых скважин. 1. Термодинамическое исследование скважин. Известно, что колебания температуры на земной ... геотерма. Термограмма - распределение температуры в работающей скважине имеет отклонения от геотермы, которые связаны с термодинамическими и гидродинамическими процессами, происходящими в продуктивном ...
5. Уплотнение (заливка)
При заливке кусочки предварительно пропитываются теми жидкостями, которые служат растворителями для парафина (ксилол или толуол).
Заливка в парафин. При заливке в парафин кусочки из абсолютного спирта переносятся в смесь абсолютного спирта с хлороформом или ксилолом, взятых поровну, затем чистый ксилол и, наконец, в расплавленный насыщенный раствор парафина в хлороформе, где они находятся в термостате при температуре 37є до 1 суток и более. Дальнейшая заливка проводится в термостате при температуре 54є -56є в трех порциях парафина. Окончательная заливка проводится в парафин с добавлением воска, который наливают в специальные бумажные коробочки или стеклянные чашки, а затем эти коробочки или чашки после появления на поверхности парафина пленки, погружают в воду.
Происходит полное затвердение парафина. Кусочки с окружающим их парафином извлекают из коробочек и с помощью расплавленного парафина, наклеивают на деревянные кубики, получаются парафиновые блоки.
Уплотнения также можно добиться замораживанием кусочка органа (срочная биопсия).
6. Приготовление срезов
Срезы с блоков изготовляются на микротоме. Наиболее распространены микротомы санный и замораживающий. В специальных устройствах микротома зажимается парафиновый блок и микротомный нож. Существует механизм, поднимающий объектодержатель с блоком на заданное количество микрометров. Это позволяет при каждом скольжении ножа в плоскости параллельной поверхности блока получать срезы толщиной 5-10 микрометров с парафиновых блоков.
7. Окрашивание
Изготовленные на микротоме срезы окрашиваются. Перед окраской из парафиновых срезов обязательно удаляют парафин (растворением в ксилоле).
Окрашивание необходимо производить для того, чтобы отчетливо выявить под микроскопом тонкие структуры объекта. В неокрашенных срезах большинство структур одинаково преломляет свет, поэтому рассмотреть их не удается.
Выявление на срезе гистологических структур основано на неодинаковом их отношении к красителям. Одни структуры среза вступают в реакцию с кислыми красителями и ими окрашиваются (ацидофильные, оксифильные структуры), другие реагируют с основными красителями и окрашиваются преимущественно ими (базофильные структуры).
Некоторые структуры окрашиваются и кислыми и основными красителями.
По происхождению различают краски естественные, к которым относятся краски растительного и животного происхождения, и краски искусственные. Краской растительного происхождения является гематоксилин, который добывается из кампешевого дерева, растущего в Америке и в Армении.
К краскам животного происхождения относится кармин, который добывается из насекомых кошенили, живущих на кактусовых деревьях в Мексике, Армении и др. В настоящее время большинство красок готовят синтетически (искусственные краски).
Парафин воскоподобное вещество смесь предельных углеводородов ...
... ёлтого к светло-коричневому (неочищенные парафины). Для парафина характерна пластинчатая или ленточная структура кристаллов. Очищенный парафин имеет плотность 881—905 кг/м³. ... из озокерита. В зависимости от фракционного состава, температуры плавления и кристаллической структуры парафины разделяют на жидкие (t пл ≤ 27 °C), твердые ( ... кустаря». М.-Л., Гиз, 1931 Данный реферат составлен на основе .
По окрашиванию определенных гистологических структур различают краски ядерные (окрашивание ядра), цитоплазматические (окрашивающие цитоплазму), и специальные, окрашивающие избирательно определенные структуры.
Ядерные краски — гематоксилин, кармин, сафранин, метиленовая синь, азур, тионин.
Цитоплазматические краски — эозин, пикрофуксин.
Существуют специальные краски и реактивы: судан Ш (окрашивает жир в оранжевый цвет), осмиевая кислота (импрегнируемый ею жир окрашиватся в черный цвет), резорцинфуксин Вейгерта (дает темно-синюю окраску эластических волокон), орсеин (окрашивает эластические волокна в бурый цвет).
Метиленовый синий окрашивает нервные элементы в синий цвет, а при импрегнации серебром они приобретают коричневый цвет.
Чаще всего для окрашивания гистологических срезов применяется окрашивание раствором гематоксилина (приготовленным по методу Бемера) и 1-2% эозином [3].
8. Заключение среза
Окрашенные и промытые в воде срезы во избежание помутнения обезвоживают в спиртах (70є, 96є), просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле, а затем на предметное стекло, где находится срез, помещают каплю бальзама и срез накрывают покровным стеклом. Бальзам представляет собой растворенную в ксилоле смолу одного из видов сосны, растущей в Канаде (канадский бальзам), смолу пихты (сибирский бальзам) или специальную синтетическую среду.
При исследовании биопсий с целью уточнения диагноза в гистологических лабораториях прибегают к ускоренной обработке материала. Кусочки тканей и органов при этом проходят те же этапы обработки, но за 5-7 дней. Иногда производится так называемая срочная биопсия, когда в течение 15-80 мин. материал фиксирует, получают срезы, окрашивают их и заключают. Быструю фиксацию производят в 10% формалине, подогреваемом пламенем горелки или с использованием СВЧ-печи. Уплотнения добиваются замораживанием (хлорэтилом, углекислотой или с помощью замораживающего микротома).
2. Примерная схема окраски препаратов гематоксилин
1. Парафиновые или замороженные срезы доводят до воды.
2. Окраска гематоксилином — в течении 3-5 минут.
3. Промывка в воде — 2 минуты.
4. Дифференцировка в спирте, подкисленном соляной кислотой (1% раствор соляной кислоты в 70% спирте), несколько секунд с последующим восстановлением подщелоченной водой (около 1 минуты).
Этот этап желателен, но не обязателен.
5. Промывка в проточной воде.
6. Ополаскивание дистиллированной водой.
7. Окраска 1% эозином — 1-2 минуты.
8. Ополаскивание дистиллированной водой.
9. Обезвоживание в спирте — 2 мин.
10. Просветление в ксилоле — 2 мин
11. Заключение среза — капля бальзама, покровное стекло.
3. Методы исследования в гистологии и цитологии
Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью микроскопа.
Основным методом гистологического исследования является световая микроскопия, разновидностями которой являются:
фазово-контрастная микроскопия
интерференционная микроскопия
поляризационная микроскопия
Современные методы микроскопических исследований
... свете. Широкому развитию методов микроскопических исследований и совершенствованию различных типов М. во 2-й половине 19 и в 20 вв. ... микроскопию применяют в основном в нейроморфологии и офтальмологии. 1.8 Стереоскопическая микроскопия Для исследования объемных объектов используют стереоскопическую микроскопию. Конструкция стереоскопических микроскопов позволяет видеть объект исследования правым и ...
люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия
ультрафиолетовая микроскопия
Для изучения тонкого внутреннего строения клеток и межклеточных структур (ультраструктур) используют электронную микроскопию.
Для выявления в клетках различных химических соединений (аминокислот, белков, жиров, углеводов, минеральных веществ и т.д.) используют гистохимические методы исследования, основанные на использовании красителей, которые избирательно связываются только с теми химическими соединениями клетки, которые необходимо изучить, и окрашивают их, делая видимыми.
Метод радиоавтографии, основанный на введении в клетку изотопов, которые включаются в соответствующие структуры (например, меченый тимидин встраивается в ядра клеток, синтезирующих ДНК), используется для изучения течения синтетических процессов в тканях.
Для изучения механизмов пролиферации и дифференцировки клеток, их реакции на различные воздействия используют метод культуры клеток и тканей, который основан на выращивании вне организма в искусственных питательных средах различных клеток.
Одним из современных методов, используемых в гистологии, является конфокальная микроскопия, которая позволяет получать трёхмерное изображение исследуемого объекта с помощью специальных компьютерных программ[1].
Литература
[Электронный ресурс]//URL: https://drprom.ru/kontrolnaya/ustroystvo-gistologicheskoy-laboratorii/
гистологический цитология гематоксилин эозин
[1].
http://do.teleclinica.ru/443753/
[2].
http://survincity.ru/2010/12/gistologicheskaya-texnika-2/
[3].
http://medencped.ru/gistologicheskaya-texnika/
