В данной работе описаны следующие методы: микробиологическая чистота, пирогенность, стерильность, аномальная токсичность, испытание на бактериальные эндотоксины и депрессорные вещества. Эти методы описаны в ГФ XIV, ГФ XIII и других фармакопеях, причём с принятием и вступлением в силу ГФ XIV издания данные методы остались неизменными.
Цель данной работы — изучить общие методы биологического контроля лекарственных средств.
Для достижения поставленной цели необходимо выполнить следующую задачу — проанализировать методики биологического контроля лекарственных средств, биологических лекарственных средств, средств для парентерального применения, исключая специфические методы для лекарственных средств конкретных фармацевтических групп, а именно испытания на микробиологическую чистоту, пирогенность, стерильность, аномальную токсичность, бактериальные эндотоксины и депрессорные вещества.
1. Микробиологическая чистота
Микробиологическую чистоту в соответствии с данной статьёй можно определить в нестерильных лекарственных веществах, биологических лекарственных средствах, содержащих живые микроорганизмы, во вспомогательных веществах и полупродуктах, а также при определении эффективности антимикробных консервантов и при контроле производственных помещений фармацевтических предприятий и лабораторий.
Для разных препаратов указаны различные рекомендуемые требования к качеству, отдельно указаны рекомендуемые нормы для фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ.
Определение микробиологической чистоты проводится в асептических условиях с помощью описанных ниже методов и питательных сред. Испытание начинается с подготовки различных форм препаратов и фармацевтических субстанций, отбора образцов для анализа, выбора методов количественного определения жизнеспособных микроорганизмов, обнаружение и установление отдельных видов бактерий, наличие которых недопустимо или ограничено в лекарственных средствах, а также питательные среды, растворы, реактивы, применяемые для проведения испытаний.
Лекарственные средства
... классификации лекарственных средств; г) внедрение лекарственных препаратов в медицинскую практику; д) будущее фармакологии. Фармакология - это наука о действии химических соединений на живые организмы. В основном фармакология изучает действие лекарственных средств, применяемых ...
1.1 Работа с тест-штаммами микроорганизмов
При проведении испытания используют тест-штаммы микроорганизмов, указанные в официальных российских и иностранных коллекциях, например Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ), Российской коллекции патогенных грибков (РКПГ), Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) РАН, Американской коллекции типовых культур (АТСС), Национальной коллекции типовых культур (NCTC), Коллекции культур института Пастера (CIP), Институт гигиены и эпидемиологии (IHE).
Ампулы открывают в асептических условиях, соблюдая указания в инструкции производителя.
Для восстановления жизнеспособности культуры необходимо как минимум 2 пересева на питательной среде, подходящей по биологическим свойствам данному штамму, при инкубации в оптимальных для данного штамма температурных условиях. Для получения изолированных колоний тест-штамма проводят пересев на соответствующую плотную питательную среду.
По окончанию инкубации культуры изучают морфологические свойства выросших колоний, изучают под микроскопом мазки, окрашенные по Граму, биохимические свойства колоний с помощью тест-систем, разрешенных к использованию. Тест-штамм микроорганизма должен обладать типичными морфологическими, тинкториальными, биохимическими свойствами, соответствующими свойствам, представленными сертификатами коллекции.
После подтверждения свойств тест-штамма культуру пересевают на соответствующую питательную среду (первый пассаж) и инкубируют в стандартных условиях.
Если тест-штамм хранят на диске, то его помещают в жидкую питательную среду, подходящую по потребностям данному микроорганизму, после чего инкубируют в соответствующих условиях и далее повторяют произведённые операции в той же последовательности, как при активации лиофилизированной культуры, описанной выше.
1.2 Определение антимикробного действия
Для предупреждения неверной оценки получаемых результатов следует определить вероятность проявления лекарственным средством антимикробного действия в отношении определенных видов микроорганизмов перед непосредственно испытанием на микробиологическую чистоту. Сущность метода определения антимикробного действия состоит в сравнении интенсивности роста тест-штаммов микроорганизмов в присутствии испытуемого препарата и без него.
Для ликвидации антибактериального действия ЛС фармакопеей предложены следующие методы:
1. Увеличение разведения препарата, повышая количество разбавителя или питательной среды в установленных границах приемлемой микробной контаминации (в качестве разбавителя используют стандартный фосфатный буферный раствор или нейтрализующую жидкость);
2. Использование специфичных инактиваторов (например, в-лактамазы для инактивации в-лактамных антибиотиков и пара-аминобензойной кислоты (ПАБК) для инактивации сульфаниламидных препаратов), которые нейтрализуют противомикробное действие препарата, но при этом не ингибируют рост микроорганизмов, которые контаминируют ЛС;
- Табл.1 Инактиваторы антимикробного действия ЛС
|
Химические соединения |
Инактивирующие вещества или метод |
|
|
Глутаровый альдегид, ртутьсодержащие соединения |
Гидросульфит натрия (бисульфит натрия) |
|
|
Фенолы, спирты, альдегиды, сорбаты |
Разведение |
|
|
Альдегиды |
Глицин |
|
|
Четвертичные аммониевые соединения (ЧАС), бисбигуаниды, пара-гидроксибензоаты (парабены) |
Лецитин |
|
|
ЧАС, йодсодержащие соединения, парабены |
Полисорбат, твин-80 |
|
|
Ртутьсодержащие соединения |
Тиогликолят |
|
|
Ртутьсодержащие соединения, галогены, альдегиды |
Тиосульфат |
|
|
Соли этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) |
Ионы Mg(II) или Са(II) |
|
3. Применение неспецифических инактиваторов для препаратов с консервантами. После проведения валидации в буферный раствор и (или) в питательные среды могут быть добавлены твин-80, соевый или яичный лецитин и др.;
4. Для водорастворимых препаратов или препаратов, растворимых в изопропилмиристате (ИПМ), используют метод мембранной фильтрации с последующим промыванием фильтров.
Если при анализе лекарственного средства все описанные способы подавления противомикробного действия оказались неэффективны, этот вид испытания не проводят.
1.3 Отбор образцов ЛС
От каждой изучаемой серии ЛС для проведения испытания отбирают необходимое количество образцов в соответствии с категорией препарата из достаточного числа разных упаковок. В некоторых случаях (при высокой стоимости препарата и/или малом объеме серии) образец может быть уменьшен в отдельных случаях до 2 — 3 г (мл).
Уменьшение количества образца с указанием метода испытания должно быть обосновано и утверждено в нормативной документации в установленном порядке. Количество образцов в г или мл для каждой лекарственной формы подробно расписано в ГФ.
1.4 Методы количественного определения микроорганизмов
1.4.1 Чашечные агаровые методы
Для культивирования микроорганизмов используют агаризованные питательные среды: соево-казеиновый агар или среду № 1 сухую для контроля микробной загрязненности — для выращивания бактерий, агар Сабуро с глюкозой или среду № 2 сухую для контроля микробной загрязненности — для выращивания дрожжевых и плесневых грибов.
Существуют несколько чашечных агаровых методов:
- Глубинный метод
- Двухслойный метод
- Поверхностный метод
- Модифицированный глубинный метод
Посевы просматривают ежедневно. Подсчет колоний производят через 48 — 72 ч (предварительный результат) и через 5 сут (окончательный результат).
Количество микроорганизмов (N) в 1 г или в 1 мл рассчитывают по формуле:
где:
с — количество колоний на всех чашках Петри;
n — число чашек Петри;
d — коэффициент разведения образца;
10 — коэффициент пересчета при проведении высева на чашку в объеме 0,1 мл.
Нормы допустимой микробной загрязненности интерпретируют следующим образом:
§ если количество микроорганизмов в 1 г или в 1 мл не более 10 2 КОЕ — максимально допускается 2 102 КОЕ/г или мл;
§ если количество микроорганизмов в 1 г или в 1 мл не более 10 3 КОЕ — максимально допускается 2 103 КОЕ и т.д.
1.4.2 Метод мембранной фильтрации
Жидкий образец или его разведение фильтруют в асептических условиях через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45-0,8 мкм. Содержащиеся в образце микроорганизмы задерживаются на фильтре, после чего фильтр помещают в чашку Петри на питательную среду и инкубируют при определенной температуре. Удержанные на фильтре микроорганизмы в процессе инкубирования вырастают в колонии.
Для промывания фильтров можно использовать любую стерильную жидкость, не подавляющую рост микроорганизмов (изотонический раствор хлорида натрия, раствор ферментативного пептона, раствор твина-80 и др.)
1.4.3 Метод наиболее вероятных чисел (НВЧ)
Метод НВЧ используют при испытании ЛС с низким уровнем микробной контаминации, а также в тех случаях, когда нельзя применить другие методы. Метод НВЧ менее чувствителен и точен по сравнению с чашечным агаровым методом или методом мембранной фильтрации, и его используют только для определения общего числа бактерий, так как результаты, полученные при определении общего числа грибов, особенно плесневых, считают недостоверными.
Исследуемый образец готовят в виде раствора, суспензии или эмульсии в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000, используя подходящий растворитель, и разливают в три ряда по 3 пробирки с 9 мл ЖПС в каждой. В четвёртом ряду в ЖПС вносят 1 мл разбавителя. Посевы инкубируют в стандартных условиях в течение не более 3 сут. Отмечают число пробирок в первом, втором и третьем рядах, в которых визуально наблюдают рост микроорганизмов. Среда в пробирках четвертого ряда (контроль разбавителя) должна оставаться стерильной.
1.5 Определение отдельных видов микроорганизмов
Отдельно проводятся испытания на отсутствие бактерий Escherichia coli, бактерий рода Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans. Для каждого из них предусмотрен индивидуальный качественный и количественный метод определения, подробно описанный в ФС.
1. Стерильность
Это исследование проводится для различных лекарственных средств: парентеральных лекарственных форм, пленок, глазных капель, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ, а также биологические лекарственные препараты и их растворители, которые в соответствии с нормативной документацией или фармакопейными статьями должны быть стерильными.
Данное исследование выполняют в асептических условиях в ламинарных установках, чистых помещениях или изоляторах класса чистоты. Его проводят двумя различными методами: методом прямого посева или методом мембранной фильтрации. Метод мембранной фильтрации используют тогда, когда природа препарата, его физико-химические свойства позволяют фильтровать его через мембранные фильтры. Метод прямого посева используют для испытания на стерильность ЛС, не обладающих антимикробным действием или антимикробное действие которых можно устранить разведением или инактивированием, а также для препаратов, испытание которых невозможно выполнить методом мембранной фильтрации. При испытании на стерильность параллельно проводятся соответствующие отрицательные контроли.
2.1. Метод мембранной фильтрации
При определении стерильности ЛС, обладающих выраженным антимикробным действием, и ЛС в емкостях вместимостью более 100 мл, предпочтительным является метод мембранной фильтрации. Исключение составляют препараты с антимикробным действием, нерастворимые в водных разбавителях или ИПМ.
Процедура испытания на стерильность методом мембранной фильтрации состоит из следующих основных стадий: смачивание мембран, подготовка образцов и фильтрация содержимого всех емкостей через мембранные фильтры, отмывка мембранных фильтров соответствующим стерильным раствором, добавление питательной среды и инкубирование посевов. Испытание выполняют с использованием фильтрационных установок открытого или закрытого типа, позволяющих в асептических условиях переносить и фильтровать испытуемый препарат через мембранные фильтры, способные улавливать микроорганизмы. После окончания фильтрации мембрану асептически переносят в питательную среду. Если испытуемый препарат не обладает антимикробным действием, в ходе испытания возможно исключить процедуру промывания фильтров.
2.2. Метод прямого посева
Метод прямого посева используют для испытания на стерильность ЛС, не обладающих антимикробным действием, или тех препаратов, испытание которых невозможно выполнить методом мембранной фильтрации. В том случае, если препарат обладает антимикробным действием в условиях испытания, его нейтрализуют путем добавления подходящих инактиваторов или увеличивая объем питательной среды. Добавляемый инактиватор в заданной концентрации не должен подавлять рост тест-штаммов. При необходимости инактиватор можно добавлять и в питательную среду.
Испытуемые образцы засевают непосредственно в питательные среды в соотношении 1:10 или 1:20. Соотношение количества испытуемого материала и используемой питательной среды должно быть определено при проверке антимикробного действия препарата. Для ИЛП, вызывающих помутнение питательной среды (препараты, содержащие сорбент, микробные клетки и др.), когда визуально нельзя определить наличие или отсутствие роста микроорганизмов или возникают сомнения при учете результатов, посев производят по указанной выше схеме, а на 5-7 сут производят пересев на свежую питательную среду. Все посевы выдерживают при адекватной температуре до окончания инкубации (14 сут со дня первичного посева).
В обоих методах посевы инкубируют не менее 14 сут при температуре 32,5 ± 2,5о С в жидкой тиогликолевой среде и при температуре 22,5 ± 2,5о С в жидких соевоказеиновой среде или среде Сабуро (независимо от метода посева).
Во время инкубации периодически просматривают посевы. Наличие роста микроорганизмов определяют визуально в проходящем свете. При отсутствии роста микроорганизмов, считают, что испытуемый препарат соответствует требованиям испытания на стерильность. При обнаружении роста микроорганизмов, определяемого визуально по наличию мутности, осадка, хлопьев и других изменений среды и подтверждаемого микроскопическим исследованием, считают, что испытуемый препарат не соответствует требованиям испытания на стерильность. В этом случае проводят расследование причин несоответствия. Результаты испытания на стерильность могут быть признаны недостоверными в случае, если выполняется одно или несколько условий, приведенных ниже:
- получены неудовлетворительные результаты микробиологического контроля окружающей среды (воздушной среды, поверхностей и рук персонала и др.) при проведении испытания на стерильность;
- выявлены ошибки, допущенные в ходе испытания;
- обнаружен рост микроорганизмов в отрицательном контроле (контроль стерильного растворителя/разбавителя или питательной среды);
- питательная среда нестерильна и/или её ростовые свойства неудовлетворительны;
- выявлены ошибки в ходе процесса стерилизации материалов.
Если результаты испытания признаны недостоверными (в случае обнаружения ошибок в ходе анализа), тест повторяют на том же количестве образцов, что и первоначально. Если в результате повторного испытания не обнаруживают рост микроорганизмов, считают, что препарат соответствует требованиям испытания на стерильность. Если в результате повторного испытания обнаруживают рост микроорганизмов, считают, что препарат не соответствует требованиям испытания на стерильность.
3. Аномальная токсичность
Данное испытание лекарственных средств проводится для веществ природного происхождения, для лекарственных средств, получаемых из крови, органов, тканей человека или животного, растительного сырья, микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности при производстве из них готовых лекарственных форм. В основном оно используется для качественного анализа лекарственных препаратов для парентерального применения. Главная цель данного теста — обнаружение аномальной токсичности данного препарата, которая превышает установленный ранее предел, обнаруживаемый при повышении летальности или появлению нерегламентированных случаев интоксикации животных. Это исследование помогает выявить необычную или повышенную токсичность исследуемого препарата, возникающую в лекарственном средстве из-за образования продуктов разложения или нежелательных примесей при изменении или несоблюдении условий хранения, транспортировки лекарственного средства, указанных в НД.
Испытание проводят на 5 здоровых белых мышах обоих полов массой около 20 г, которые ранее не использовались в экспериментах. Условия содержания и кормления должны обеспечивать нормальную жизнедеятельность животных.
Испытуемое лекарственное средство растворяют или разводят (в случае необходимости) раствором натрия хлорида 0,9% для инъекций. Тест-доза должна содержаться в объеме 0,5 мл испытуемого раствора, который вводят в хвостовую вену животного со скоростью 0,1 мл в секунду. Тест-дозу указывают в фармакопейной статье. Период наблюдения за животными составляет 48 ч.
Лекарственное средство считают прошедшим испытание, если в течение предусмотренного срока наблюдения не погибнет ни одно из подопытных животных.
В случае гибели одного животного, эксперимент повторяют на 5 мышах массой 20,0 ± 0,5 г. Если при повторном испытании не погибнет ни одна мышь, лекарственное средство считают прошедшим испытание.
Для иммунобиологических лекарственных препаратов испытания проводят на двух видах животных: на 5 белых мышах массой 18-20 г и/или на двух морских свинках, массой тела 250-300 г. Массу животных определяют в день начала испытания.
4. Пирогенность
Определяется пирогенность при контроле парентеральных растворов, а также фармацевтических субстанций, служащих компонентами в их приготовлении. Исследование состоит в мониторинге температуры тела у кроликов перед инъекцией испытываемого вещества и после неё.
Всех кроликов содержат в индивидуальных клетках на сбалансированном питании, оберегая от раздражителей (звуковых, световых и прочих).
В специальных помещениях, где находятся животные и проводятся испытания, сохраняют неизменную температуру воздуха 20 ± 3 єС. Животных обязательно осматривают перед началом испытаний, после чего выбирают здоровых кроликов одного пола, не альбиносов, с массой тела 2,0 — 3,5 кг, не терявших в массе за прошлую неделю.
За 18 часов до начала исследования кроликов лишают корма, оставляя возможность пить воду без ограничений. В течение опыта животных лишают и корма и воды. Кроликов, не участвовавших в исследованиях ранее или участвовавших более четырех недель назад, заранее подготавливают к процедуре испытания, выполняя все необходимые проверки (внещний осмотр, взвешивание, измерение температуры тела).
Кроликов, которые уже использовались в испытаниях ранее, снова можно использовать только через трое суток после испытания, если средство прошло испытание и не было пирогенным. Если температура тела животного повысилась на 0,6 єС и более, перед повторным испытанием кролика нужно переждать две недели.
Если испытуемое лекарственное средство обладает антигенными свойствами, то порядок повторного использования животных для испытаний указывают в фармакопейной статье.
Посуда для разведения, шприцы и иглы для инъекций, используемые в испытании, должны быть стерильными и апирогенными, что обеспечивается нагреванием при температуре 250єС в течение 30 минут или 200єС в течение 60 минут.
Для разведения испытуемых лекарственных средств используют 0,9 % изотонический раствор натрия хлорида для инъекций, если в фармакопейной статье не указан другой растворитель. Все растворители должны быть стерильными и апирогенными.
В начале испытания у кроликов измеряют ректальную температуру с точностью до 0,1єС с помощью медицинского ртутного или электронного термометра с термочувствительным датчиком. В ушную вену кролика вводится испытуемое лекарственное средство (если в ФС не рекомендован иной путь введения).
Объем вводимого раствора должен быть не менее 0,2 мл и не более 10 мл на 1кг массы тела животного. Раствор исследуемого вещества перед введением подогревают до температуры 37єС. Повторное определение температуры тела кролика после внутривенного введения испытуемого лекарственного средства проводят с перерывом не более 30 минут на протяжении трех часов. При иных путях парентерального введения — на протяжении пяти часов.
Исследование лекарственного средства можно проводить в несколько этапов, на каждом из которых проверяют трёх кроликов. Рекомендуется проводить не более четырёх этапов. После каждого из этапов вычисляют максимальное изменение температуры (Dt) тела каждого кролика по сравнению с исходным значением. Если температура тела кроликов после введения наоборот уменьшилась, то данное значение принимают за 0 и не учитывают при анализе.
Для трех кроликов определяют сумму индивидуальных максимальных повышений температур, значения, полученные на разных этапах испытания, последовательно суммируют, а результаты сравнивают с уровнями, указанными в ФС.
После первого этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 1,2 єС, а индивидуальное повышение температуры ни у одного из трех кроликов не превышает 0,5 єС.
Если результат, полученный на первом этапе, превышает 1,2 єС или зарегистрировано индивидуальное повышение температуры более чем на 0,5 єС хотя бы у одного из трех кроликов, то необходимо перейти к проведению следующего этапа испытания.
После второго этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 2,8єС, а индивидуальное повышение температуры свыше 0,5єС отмечено не более, чем у одного из шести кроликов.
Если результат, полученный на втором этапе испытания, больше 2,8єС, но меньше 4,3єС, или более, чем у одного животного зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5єС, то необходимо перейти к проведению следующего этапа испытания.
После третьего этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 4,5єС, а индивидуальное повышение температуры свыше 0,5єС отмечено не более, чем у двух из девяти кроликов.
Если результат, полученный на третьем этапе испытания, больше 4,5єС, но меньше 6,0єС, или зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 єС более, чем у двух животных, то необходимо перейти к проведению следующего этапа испытания.
После четвертого этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 6,6 єС, а индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 єС отмечено не более, чем у трех из двенадцати кроликов.
Лекарственное средство признают пирогенным, если результат на втором или последующих этапах испытания выше, чем величины, указанные в таблице в ФС. Лекарственное средство признают пирогенным и в том случае, если в результате четырех этапов испытания зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5єС более, чем у трех кроликов из двенадцати.
Рис. 1 Оценка результатов испытания
5. Бактериальные эндотоксины
Бактериальные эндотоксины определяют в лекарственных препаратах, предназначенных для парентерального применения, и фармацевтических субстанциях, используемых для их изготовления.
Определение содержания бактериальных эндотоксинов проводят с помощью реактива, представляющего собой лизат клеток крови мечехвоста Limulus polyphemus (ЛАЛ-реактив) или Tachypleus tridentatus (ТАЛ-реактив).
ЛАЛ-реактив специфически реагирует с бактериальными эндотоксинами. В результате ферментативной реакции происходит изменение реакционной смеси, пропорциональное концентрации эндотоксина.
Каждый отобранный образец испытывается индивидуально.
Для растворения и/или разведения испытуемого лекарственного средства используют воду для ЛАЛ-теста, если в фармакопейной статье не указан иной растворитель. Испытуемый раствор должен иметь рН в пределах, указанных производителем ЛАЛ-реактива, обычно 6,0 — 8,0. В случае необходимости рН доводят до нужного значения растворами кислоты, основания или с помощью буферного раствора. Используемые растворы не должны содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте, и не должны оказывать влияния на ход реакции.
Существуют три основных методологических подхода для проведения данного испытания: гель-тромб метод, основанный на образовании геля; турбидиметрический метод, основанный на помутнении реакционной смеси после расщепления субстрата, содержащегося в ЛАЛ-реактиве; и хромогенный метод, основанный на появлении окрашивания после расщепления синтетического пептид-хромогенного комплекса.
5.1
5.1 Гель-тромб метод
Данный метод позволяет установить наличие или измерить количественно концентрацию эндотоксинов в пробе. В результате реакции ЛАЛ-реактива с эндотоксином увеличивается вязкость реакционной смеси вплоть до формирования плотного геля.
Для обеспечения точности и достоверности испытаний заявленную чувствительность ЛАЛ-реактива следует подтвердить, а также провести испытание на наличие мешающих факторов, как описано в разделе «Предварительные анализы» в ОФС.1.2.4.0006.18.
В круглодонные пробирки диаметром 10 мм вносят равные объемы испытуемого раствора и ЛАЛ-реактива (по 0,1 мл).
Реакционные смеси аккуратно перемешивают и инкубируют при температуре 37 ± 1 °С в течение 60 ± 2 минут. Во время инкубирования следует избегать вибрации и ударов. По истечении указанного срока визуально регистрируют результаты как положительные или отрицательные. Положительная реакция (+) характеризуется образованием плотного геля, который не разрушается при аккуратном однократном переворачивании пробирки на 180°. Отрицательная реакция (-) характеризуется отсутствием такого геля.
5.2 Турбидиметрические методы
Относятся к фотометрическим методам, которые основаны на определении степени мутности или непрозрачности реакционной смеси. Данный метод можно провести по конечной точке или как кинетический анализ в зависимости от принципа, который выбран в основу исследования.
Турбидиметрический тест по конечной точке заключается в определении степени мутности реакционной смеси в после инкубационного периода, зависящей от концентрации эндотоксина.
Турбидиметрический кинетический тест основан на определении скорости развития мутности реакционной смеси, измеряемой по времени, необходимому для достижения заданной величины оптической плотности.
Испытание проводят при температуре инкубирования, рекомендованной производителем ЛАЛ-реактива (обычно 37 ± 1°С).
5.3 Хромогенные методы
Данные методы используют для измерения количества хромофора, высвободившегося из хромогенного субстрата в результате реакции эндотоксинов с ЛАЛ-реактивом. В зависимости от принципа, положенного в основу испытания, этот метод может быть проведен как хромогенный тест по конечной точке или как хромогенный кинетический анализ.
Хромогенный тест по конечной точке основан на измерении интенсивности окраски реакционной смеси, зависящей от количества хромофора, высвободившегося в конце инкубационного периода. Количество, выделившегося хромофора, зависит от концентрации эндотоксина.
В процессе испытания хромогенным кинетическим методом определяют скорость развития окраски реакционной смеси, измеряемой по времени, необходимому для достижения заданной величины оптической плотности реакционной смеси.
Испытание проводят при температуре инкубирования, рекомендованной производителем ЛАЛ-реактива (обычно 37 ± 1°С).
6.
6. Испытание на депрессорные вещества
Проводится для инъекционных препаратов для парентерального введения и фармацевтических субстанций для из изготовления.
Для опыта используют здоровых кошек любого пола массой 2 кг и более. Беременных или лактирующих кошек не используют. За сутки до начала исследования животное лишают корма, но не ограничивают в воде. Для наркоза разрешается применять любое наркотизируещее средство, не оказывающее значительное воздействие на показатель артериального давления (например уретан).
Животноезакрепляют в станке в лежачем на спине положении. Вскрывают сонную артерию, в неё вставляют канюлю с антикоагулянтом, предупреждающим свертывание крови (чаще всего используют 25 % раствор магнезии или раствор гепарина).
Канюлю несколькими трубками с раствором антикоагулянта соединяют с ртутным манометром или электронным датчиком контроля артериального давления. Регистрация этого показателя происходит на ленте кимографа или иного записывающего устройства. Испытуемый образец вводят через иглу, введённую во вскрытую бедренную вену.
Как стандартный образец используют гистамина дигидрохлорид. Каждое разведение производят с пересчётом на гистамин-основание (коэффициент пересчёта с гистамина дигидрохлорида на гистамин-основание равен 0,6038).
Для разведения стандартного образца берут тот же растворитель, что использовался для испытуемого образца, обычно это 0,9 % изотонический раствор натрия хлорида для инъекций. Концентрация рабочих разведений стандартного образца в пересчёте на гистамин-основание должна составлять 0,5 мкг/мл (разведение первое) и 1,0 мкг/мл (разведение второе).
Вводят растворы во время опыта со скоростью 0,1 мл в секунду и с перерывом между инъекциями 5 мин и более.
Начинают испытание с определения восприимчивости животного к гистамину. С этой целью в вену вводят сначала стандартный образец первого разведения, а затем и второго разведения по 0,2 мл на 1 кг массы тела кошки. Животные, артериальное давление которых после введения стандартного образца в разведении 2 дозой 0,2 мкг на 1 кг массы снизится меньше чем на 20 мм рт.ст., отсеивают из испытания. Раствор гистамина в первом разведении вводят дважды, чтобы подтвердить стабильность реакции артериального давления кошки.
После этого кошке один раз вводят раствор испытуемого образца. Тест-доза препарата и растворитель указываются в ФС.
При эксперименте на одном и том же животном двух или более исследуемых образцов нужно время от времени определять величины снижения артериального давления в ответ на введение стандартного образца в первом разведении. При значительном уменьшении реакции артериального давления на введённый исследуемый образец в сравнении со стандартной величиной, которую получили в начале опыта, нужно ещё раз измерить чувствительность животного к воздействию стандартного образца во втором разведении. При снижении артериального давления 20 мм рт.ст. и более, проверку препаратов продолжают в соответствии с требованиями, указанными в ФС.
Исследуемое лекарственное средство проходит испытание, если через 1 минуту после введения раствора испытуемого образца в исследуемой тестовой дозе артериальное давление снизится не сильнее, чем на введение стандартного образца в первом разведении .
Заключение
Сегодняшний уровень развития химических и биологических наук требует более глубокого понимания изучаемых процессов, подробного изучения химического состава различных смесей и биологических объектов. Для химического и биотехнологического производства, а также для производства лекарственных препаратов, свойственны постоянное увеличение количества требований к чистоте производимой продукции, усиление строгости методов контроля, склонность к применению количественных критериев для оценки качества. Вот почему кроме неотъемлемых параметров, свойственных объекту исследования, зачастую необходим подробный анализ компонентов, обуславливающих состояние биологических систем либо качество химических продуктов.
Часто мониторинг качества препаратов проводится с помощью только физических и химических методов, но встречаются случаи, когда этих методов мало для определения качества препарата. Непосредственный биологический анализ может помочь установить параметры, недоступные для контроля другими аналитическими методами, поэтому данные исследования чрезвычайно важны для контроля качества лекарственных средств.
В данной работе я изучила методики биологического контроля лекарственных средств, а именно контроль микробиологической чистоты, апирогенности, стерильности, аномальной токсичности, испытание на бактериальные эндотоксины и депрессорные вещества. Эти методы являются очень важными для контроля лекарственных средств, так как отклонения в показателях по данным статьям могут сильно навредить здоровью людей, принимающих лекарственные средства, не соответствующие нормам, указанным в Государственной фармакопее.
Список литературы
[Электронный ресурс]//URL: https://drprom.ru/kursovaya/biologicheskie-ispyitaniya/
1. Государственная фармакопея российской федерации. XIV издание. Том I., Москва, 2018 (ГФ XIV, том 1) — М.: Министерство здравоохранения Российской Федерации — 1814 с.
2. ОФС 1.2.4.0002.18 Микробиологическая чистота — Государственная фармакопея российской федерации. XIV издание. Том I — 1814 с.
3. ОФС 1.2.4.0003.15 Стерильность — Государственная фармакопея российской федерации. XIV издание. Том I — 1814 с.
4. ОФС 1.2.4.0004.15 Аномальная токсичность — Государственная фармакопея российской федерации. XIV издание. Том I — 1814 с.
5. ОФС 1.2.4.0005.15 Пирогенность — Государственная фармакопея российской федерации. XIV издание. Том I — 1814 с.
6. ОФС 1.2.4.0006.15 Бактериальные эндотоксины — Государственная фармакопея российской федерации. XIV издание. Том I — 1814 с.
7. ОФС 1.2.4.0010.18 Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар — Государственная фармакопея российской федерации. XIV издание. Том I — 1814 с.
8. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. — М.: Медицинское информационное агентство, 2005. — 736 с.
10. Вартанян Р.С. Синтез основных лекарственных средств. — М.: Медицинское информационное агентство, 2005. — 848 с.
11. Гроссман В.А. Фармацевтическая технология. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. — 320 с. 12. Под редакцией Н.А. Тюкавкиной. Стандартизация и контроль качества лекарственных средств. — М.: Медицинское информационное агентство, 2008. — 384 с.
13. Контроль качества и стандартизация лекарственных средств. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2018. — 352 с.
14. Макаев Ф., Жунгиету Г. Химия лекарственных средств. — М.: Palmarium Academic Publishing, 2015. — 584 с.
15. Максимкина Е.А., Миназова Г.И., Чукреева Н.В. Стандартизация и обеспечение качества лекарственных средств. — М.: Медицина, 2008. — 256 с.
16. Матюхина З.П. Основы физиологии питания, микробиологии, гигиены и санитарии. — М.: Академия, 2012. — 356 с.
17. Морозова Т.Е., Хосева Е.Н., Вартанова О.А.,. Рыкова С.М. Контроль безопасности лекарственных средств. Практические вопросы фармаконадзора. — М.: Медицинское информационное агентство, 2014. — 112 с.
18. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Общая микробиология. — М.: Академия, 2007. — 288 с.
19. Никитина Е.В, Киямова С.Н., Решетник О.А. Микробиология. — М.: ГИОРД, 2009. — 400 с. 19.Сбойчаков В.Б. Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований. — М.: СпецЛит, 2011. — 616 с.
20. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований. — М.: Медицина, 2004. — 576?с.
21. Писарев Д., Новиков О. Контроль качества лекарственных средств. — Ростов-на-Дону: Феникс, 2018. — 494 с.
23. Под редакцией Воробьева А.А. Микробиология и иммунология. — М.: Медицина, 1999. — 464 с.
24. Чимитов Д. Мониторинг рынка лекарственных средств. — М.: LAP Lambert Academic Publishing, 2013. — 68 с.
25. Шильникова В.К., Ванькова А.А., Годова Г.В.. Микробиология. — М.: Дрофа, 2006. — 288 с.
